Fig. 1 Schematisches Diagramm des Festphasen-Polypeptids
1963 schlug Merrifield ein Festphasen-Peptidsyntheseverfahren vor, das einen breiten Raum für die Peptidforschung eröffnete und die Entwicklung der Molekularbiologie und anderer Gebiete stark förderte. Dafür erhielt Merrifield 1984 den Nobelpreis für Chemie.
Seit den 1990er Jahren wurden mit der allmählichen Reifung der Polypeptidsynthesetechnologie immer mehr aktive Polypeptide entwickelt und in den Bereichen Medizin, Lebensmittel, Kosmetik, Landwirtschaft, Tierhaltung usw. weit verbreitet. Das Festphasen-Polypeptid-Syntheseverfahren wurde ebenfalls weithin verwendet. In dieser Arbeit werden die Festphasensynthese und Spaltung von Peptiden gemäß Solid Phase Peptide Synthesis Reactor vorgestellt.
Abbildung 2 Feldanwendung eines vollständigen Festphasen-Polypeptidsynthesereaktors
I. Harzrisse
ich. Einspeisung
Hinzufügen von Harz zu einer Festphasensynthese, Hinzufügen von DCM zum Quellen, Abtropfen, Hinzufügen von DMF zum Waschen, nach dem Waschen, Abtropfen für Standby.
ii. Kondensation
Auflösen der Aminosäure in einem bestimmten Volumen DMF, Zugabe eines Kondensationsmittels zur Aktivierung, Einbringen in einen Festphasen-Synthesizer, Ergänzen von DMF auf die Reaktionskonzentration und Rühren zur Reaktion.
iii. Abspaltung der Schutzgruppe Der Reaktionsgrad wurde mit Kaiser-Reagenz nachgewiesen. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Lösungsmittel abgepumpt, gefolgt von Waschen mit DMF. PIP/DMF-Lösung wurde zugegeben, um die Schutzgruppe zu entfernen. Der Reaktionsgrad wurde mit Kaiser-Reagenz nachgewiesen. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Lösungsmittel abgepumpt, gefolgt von einer DMF-Wäsche, in der die nächste Aminosäure zugegeben wurde.
iv. Kondensationszyklus
Sequenzielles Verbinden von Aminosäuren gemäß der Harzsequenz, Durchführen eines Kondensationszyklusvorgangs gemäß den Schritten „Entschützen – Waschen – Aktivieren von Aminosäuren – Zuführen von Kondensation – Waschen“ und Vervollständigen der Kondensation der verbleibenden n Aminosäuren gemäß der Aminosäuresequenz .
ich. Entladen
Nach der Synthese wurde das Harz mit IPA und DCM kreuzweise gewaschen, um die Harzkontraktion zu vervollständigen und auf die Edelstahlschale abzugeben.
ii. Harztrocknung
Trocknen des Harzes im Vakuumtrockenschrank bei Raumtemperatur, Wiegen nach dem Trocknen und Berechnen der Ausbeute.
iii. Flüssige Rückgewinnung organischer Abfälle, zentralisierte Behandlung.
iv. Clearing
Der Betreiber hat das Gelände rechtzeitig nach dem Betrieb zu räumen.
I. Harzrisse
ich. Flüssige Zubereitung
Bereiten Sie diese Lyselösung entsprechend dem Komponentenanteil der Lyselösung vor und legen Sie die Lyselösung im Voraus zur kalten Lagerung in einen Gefrierschrank.
ii. Einspeisung
Zugabe von Peptidharz in einen Reaktionskessel, Zugabe von vorgekühlter Crackflüssigkeit und Rühren zur Reaktion.
iii. Entladen
Ablassen dieser Reaktionslösung nach dem Cracken, Filtrieren zum Entfernen von Harz und Waschen mit TFA.
iv. Konzentration
Überführen Sie diese gecrackte Flüssigkeit in einen Rotationsverdampfer, um sie bei Raumtemperatur auf ein kleines Volumen zu konzentrieren.
v. Niederschlag
Die konzentrierte Reaktionslösung wird in vorgekühlten Methyl-tert.-butylether (abgekürzt als Ether) gegossen und gerührt, um eine große Menge Feststoff auszufällen.
vi. Zentrifugation
Die trübe Flüssigkeit wird zentrifugiert und mit vorgekühltem Ether gewaschen.
ich. Rohpeptidtrocknung
Das gereinigte Rohpeptid wurde zum Trocknen bei Raumtemperatur in einen Vakuumtrockenschrank überführt.
ii. Flüssige Rückgewinnung organischer Abfälle, zentralisierte Behandlung.
iii. Clearing
Der Betreiber hat das Gelände rechtzeitig nach dem Betrieb zu räumen.
Abbildung 3 Vollständiger Satz des Festphasen-Polypeptidspaltungskessels
Im eigentlichen Herstellungsprozess muss das gecrackte Rohpeptid auch Prozessen wie Reinigung, Konzentrierung, Filtration und Gefriertrocknung unterzogen werden, die in dieser Arbeit nicht im Detail beschrieben werden.
Gegenwärtig ist das Verfahren zur Synthese kürzerer Peptidketten relativ ausgereift, während für Proteinsubstanzen mit größerer Molekülmasse und längeren Peptidketten die Festphasen-Synthesetechnologie gewisse Beschränkungen aufweist, und mittlerweile gibt es Probleme wie hohe Kosten und begleitet von Nebenreaktionen. Daher müssen basierend auf der Festphasensynthese von Peptiden noch neue Wege gefunden werden.