Bei der echten Tanksterilisation (echte Sterilisation) handelt es sich um einen Sterilisationsprozess, bei dem das gesamte vorbereitete Kulturmedium in einen Bioreaktor-Fermenter eingeleitet wird oder einem anderen Gerät wird Dampf eingeführt, um das Kulturmedium und die verwendete Ausrüstung auf die Sterilisationstemperatur zu erhitzen, für einen bestimmten Zeitraum aufrechtzuerhalten und dann auf die Inokulationstemperatur abzukühlen, wie in Abbildung 1 gezeigt.
Abbildung 1 Schematische Darstellung der tatsächlichen Eliminierung
Dieser Vorgang wird auch als intermittierende Sterilisation oder Batch-Sterilisation (im Vergleich zur kontinuierlichen Sterilisation) bezeichnet.
Der Volltanksterilisationsvorgang umfasst eigentlich drei Prozesse: Erhitzen, Wärmespeicherung und Kühlen. Abbildung 2 zeigt die Temperaturänderungen während der Volltanksterilisation des Kulturmediums.
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Abbildung 2 Temperaturveränderungen während der Dosensterilisation
Spezifische Schritte zur Dosensterilisation:
1. Tankreinigungsinspektion
Überprüfen Sie vor der Reinigung, ob der Ventilstatus korrekt ist. Achten Sie beim Reinigen darauf, ob die Geräte und Rohrleitungen, vor allem die Kühlleitungen, undicht sind.
Überprüfen Sie, ob das Kondenswasser im Fermentermantel abgelassen wurde, um sicherzustellen, dass sich kein Kühlwasser im Mantel befindet.
Überprüfen Sie nach der Reinigung das Innere des Tanks, um die Originalfarbe ohne sichtbare Verschmutzungen zu sehen.
2. Vorbereitung vor der Sterilisation
Sterilisieren Sie den Luftfilter des Fermenters und blasen Sie ihn mit steriler Luft trocken.
Stellen Sie sicher, dass der Tank drucklos ist. Setzen Sie die gereinigte und kalibrierte Elektrode in den Tank ein und schließen Sie das Elektrodenkabel an. Stellen Sie sicher, dass das Tankbodenventil geschlossen ist.
Geben Sie dann die vorbereiteten Materialien in den Tank, fügen Sie das erforderliche Wasser hinzu, um das Volumen gemäß den Prozessanforderungen zu erreichen, fügen Sie den Entschäumer hinzu und prüfen Sie, ob Material fehlt. Nach Abschluss umrühren, damit sich die Flüssigkeit nicht absetzt.
3. Heizung
(1) Indirekte Erwärmung
Öffnen Sie die Auslassventile des Tankkörpers, schalten Sie gleichzeitig das Kühlwasser des Mantels ab, öffnen Sie das Dampfventil des Mantels oder der Spule, leiten Sie Dampf in den Mantel oder die Spule, um die Flüssigkeit indirekt zu erhitzen, öffnen Sie leicht das Ablassventil des Mantelwassereinlassrohrs und lassen Sie das Kondenswasser im Tankkörper und im Mantel ab.
Wenn die Tanktemperatur auf 80–90 °C steigt, schließen Sie das Auslassventil allmählich.
Die Rolle der Manteldampfvorwärmung:
①Reduzieren Sie die Bildung von Kondenswasser und stellen Sie die Genauigkeit des Kulturmediumvolumens nach der Desinfektion sicher.
Zu Beginn wird Dampf direkt in den Tank eingeleitet und das kalte Material im Tank wird direkt in den Dampf geleitet, was sehr wahrscheinlich eine große Menge Kondenswasser erzeugt und das Volumen des Kulturmediums nach dem Verbrauch zu groß macht. Einige Fabriken lassen diesen Schritt aus und müssen die Menge des erzeugten Kondenswassers durch Experimente kontrollieren, um die Konzentration des Kulturmediums sicherzustellen.
②Lärm reduzieren.
Der Temperaturunterschied zwischen dem Material und dem Dampf ist zu groß und die direkte Einleitung von Dampf führt zu Vibrationen des Geräts.
③ Es fördert die Verkleisterung und Verflüssigung stärkehaltiger Rohstoffe. (Dies gilt nicht für Rohstoffe ohne Stärke)
Die Temperatur der Ummantelung steigt relativ langsam an, was sich positiv auf die vollständige Auflösung der Materialien auswirkt, die sich im Kulturmedium für stärkehaltige Materialien möglicherweise nicht vollständig auflösen, und eine durch einen zu schnellen Temperaturanstieg verursachte Gelierung und Agglomeration der Materialoberfläche verhindert, die den Sterilisationseffekt beeinträchtigt.
(2) Direkte Heizung
Nachdem Sie die Ummantelung auf 80–90 °C vorgeheizt haben , schließen Sie das Dampfeinlassventil der Ummantelung (es kann auch geschlossen werden), öffnen Sie das Dampfeinlassventil des Tanks und lassen Sie Dampf direkt in den Tank strömen, um die Tanktemperatur auf 118–121 °C zu erhöhen . Öffnen Sie verschiedene Auslassventile und hören Sie auf zu rühren.
4. Wärme- und Druckisolierung
Wenn die Materialtemperatur nahe an der durch den Prozess vorgegebenen Temperatur liegt, reduzieren Sie das Dampfventil allmählich und passen Sie das Gleichgewicht jedes Ventils an, damit Druck und Temperatur stetig den durch den Prozess geforderten Druck und die geforderte Temperatur erreichen (im Allgemeinen 0,5–2 °C leicht höher als die Kulturtemperatur, sonst sinken sie zu stark ab).
Zu diesem Zeitpunkt müssen sich alle mit dem Reaktor verbundenen Rohre in zwei Zuständen befinden: Dampfeinlass oder Dampfauslass, um die Rohre zu sterilisieren.
Während der Isolierungsphase sollte Dampf in alle Rohre unterhalb des Flüssigkeitsspiegels des Kulturmediums eingeleitet werden; Dampf sollte aus anderen Rohren oberhalb des Flüssigkeitsspiegels abgelassen werden, um eine gründliche Sterilisation ohne tote Ecken zu gewährleisten. Die Isolierung erfolgt im Allgemeinen bei 121 °C für 25–30 Minuten.
Allgemeine Gärtanks haben im Allgemeinen drei Öffnungen (Lufteinlassrohr, Auslassrohr und Probenahmerohr) für die Dampfzufuhr, den sogenannten „Dreiwege-Dampfeinlass“.
„Vierwege-Dampfauslass“ bedeutet, dass Dampf direkt aus den Abgas-, Impf-, Zufuhr- und Entschäumerrohren abgelassen wird. Bei diesen vier Wegen müssen hauptsächlich auch die Dampfeinlass- und -auslassventile geöffnet werden.
5. Koling
Nach der Sterilisation schließen Sie zunächst alle Dampfeinlassventile und reduzieren das Auslassventil leicht. Öffnen Sie dann das Lufteinlassventil, um sterile Luft einzulassen und den Tankdruck aufrechtzuerhalten. Es ist zu beachten, dass der Druck im Tank niedriger sein sollte als der Luftfilterdruck, um ein Zurückfließen des Kulturmediums zu verhindern.
Öffnen Sie abschließend das Kühlwasserventil und lassen Sie zum schnellen Abkühlen kaltes Wasser durch die Ummantelung oder Spule laufen, beginnen Sie mit dem Rühren und kühlen Sie das Kulturmedium auf die für den Fermentationsprozess erforderliche Temperatur ab .
Nach der Sterilisation muss rechtzeitig sterile Luft eingeleitet werden, um den Druck im Tank sicherzustellen (im Allgemeinen wird der Tankdruck auf 0,1 MPa eingestellt), bevor Kühlwasser zur Kühlung hinzugefügt wird.
Die Funktion der Einführung steriler Luft besteht darin, die Abkühlung zu beschleunigen und den Überdruck im Tank aufrechtzuerhalten, um zu verhindern, dass durch die Abkühlung des Kulturmediums ein Unterdruck im Tank entsteht, der leicht mit Bakterien infiziert werden oder den Bioreaktor-Fermenter beschädigen kann (der Tankdruck des Bioreaktor-Fermenters fällt auf Null und der Tankkörper wird flach gesaugt). Dies ist ein Unfall, der häufig beim Sterilisationsvorgang von Fermentationstanks mit Edelstahlmantel auftritt . Dies ist ein schwerwiegender Produktionsunfall.
Zur Beurteilung der Qualität der Sterilisation von Nährbodenbehältern werden folgende vier Kriterien herangezogen:
① Erfüllen Sie nach der Sterilisation die Sterilitätsanforderungen.
②Geringere Zerstörung von Nährstoffen;
③ Das Volumen des Kulturmediums nach der Sterilisation entspricht dem Futtervolumen.
④Weniger Schaum.
Während des Sterilisationsprozesses sollten mehrere Punkte beachtet werden:
(1) Die Rolle des Sterilisationsrührens
Bei der Volldosensterilisation spielt das Rühren eine sehr wichtige Rolle.
Der Zweck des Einschaltens des Rührwerks:
① Sorgen Sie dafür, dass die sterilisierten Materialien gleichmäßig erhitzt und übertragen werden, um die Bildung von falschem Druck während des Sterilisationsprozesses der Dose zu vermeiden.
② Vermeiden Sie Materialablagerungen. Sobald Ablagerungen und Schichtenbildungen auftreten, führt dies zu inkonsistenten Heiztemperaturen und leicht zu falschem Druck.
(2) Änderungen des Flüssigkeitsvolumens nach der Sterilisation
Bei der Herstellung des Nährbodens ist die Volumenzunahme des Nährbodens nach der Sterilisation unbedingt zu berücksichtigen.
Je länger die Sterilisationszeit, desto größer ist das Volumen. Je niedriger die Temperatur, desto größer ist das eintretende Dampfvolumen. Im Allgemeinen steigt es um etwa 10 %, was mit der Qualität des Dampfes zusammenhängt.
Der Mantel ist nicht oder unzureichend vorgewärmt, das Kondenswasser in der Dampfleitung wird nicht vollständig abgelassen, der aus dem Kesselraum austretende Dampf enthält zu viel Wasser usw., wodurch sich viel Kondenswasser bildet und das Volumen zunimmt.
(3) Berücksichtigung der Sterilisationszeit der Dose
Bei der industriellen Fermentationsproduktion wird die Phase der Wärmekonservierung üblicherweise als Sterilisationszeit betrachtet. Derzeit werden im Allgemeinen 121 °C und 30 Minuten verwendet.
Allerdings ist die zur Erzielung des gleichen Sterilisationseffektes erforderliche Sterilisationszeit in Fermentern unterschiedlicher Größe theoretisch unterschiedlich.
Der 40m 3 Bioreaktor-Fermenter wird sterilisiert und die theoretische Sterilisationszeit wird nach der Formel berechnet
Abbildung 4 : Berechnen Sie die theoretische Sterilisationszeit.
t——gibt die theoretische Sterilisationszeit in s an;
N0 – die ursprüngliche Anzahl lebensfähiger Bakterien zu Beginn der Sterilisation (t = 0), Zellen/ml;
Nt – Anzahl der nach der Zeit t verbleibenden lebenden Bakterien, Zellen/ml;
k – bakterielle Sterberatekonstante s-1, die mit der Art des Mikroorganismus und der Temperatur zusammenhängt.
Angenommen, das Kulturmedium enthält 2×107 Sporen hitzebeständiger Bakterien/ml und die Sterilisationsgeschwindigkeitskonstante bei 121 °C beträgt 0,0287 s-1.
Die erforderliche Zeit, um eine Wahrscheinlichkeit eines Sterilisationsfehlers von 0,001 zu erreichen, beträgt 23,9 Minuten. Der Sterilisationseffekt der beiden Stufen des Anstiegs der Kulturmediumtemperatur von Raumtemperatur auf 121 °C und des Abfalls von 121 °C auf die Fermentationskulturtemperatur wird hier nicht berücksichtigt.
Tatsächlich tragen Erhitzung und Temperaturerhöhung zur Sterilisation des Kulturmediums bei. Besonders deutlich ist dieser Effekt, wenn das Kulturmedium auf über 100 °C erhitzt wird.
Wenn der Sterilisationseffekt des Kulturmediums während der Heizphase berücksichtigt wird und es 15 Minuten dauert, die Temperatur des Kulturmediums von 100 °C auf 121 °C zu erhöhen , errechnet sich für die Sterilisationszeit während der Isolierphase ein Wert von 21,1 Minuten, was einer Verkürzung der Isolierzeit um 12 % entspricht.
Je größer das Volumen des Gärtanks ist, desto länger muss die Aufheizzeit zur Tanksterilisation sein, desto größer ist der Einfluss der Aufheizphase auf die Sterilisation und desto kürzer ist die entsprechende Isolierungszeit.
Kleine Tanks heizen sich schnell auf und die Aufheizzeit kann vernachlässigt werden. Die derzeit in der Fermentationsindustrie verwendeten Fermentationstanks sind relativ groß (60-100 m3), und der Sterilisationseffekt während der Heizphase sollte berücksichtigt werden, um die Zerstörung von Nährstoffen zu minimieren.
Bei Gärtanks mit einem Volumen unter 40m3 kann dieser Effekt vernachlässigt werden.
Darüber hinaus trägt die Kühlphase bis zu einem gewissen Grad auch zur Sterilisation bei, allerdings werden heutzutage häufig Schnellkühlmaßnahmen eingesetzt, die zeitlich kurz sind und bei der Berechnung im Allgemeinen nicht berücksichtigt werden.